{"id":170925,"date":"2024-10-25T12:02:33","date_gmt":"2024-10-25T15:02:33","guid":{"rendered":"https:\/\/controllab.com\/?post_type=encontros_online&p=170925"},"modified":"2026-03-30T11:11:27","modified_gmt":"2026-03-30T14:11:27","slug":"aplicacoes-avancadas-no-diagnostico-molecular-ngs","status":"publish","type":"encontros_online","link":"https:\/\/controllab.com\/es\/educacion\/reunion-online\/aplicacoes-avancadas-no-diagnostico-molecular-ngs\/","title":{"rendered":"Aplicaciones Avanzadas en el Diagn\u00f3stico Molecular (NGS)"},"content":{"rendered":"\t\t
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El Dr. Gustavo Barra, mag\u00edster en farmacolog\u00eda molecular y coordinador del sector de gen\u00f3mica en Sabin Medicina Diagn\u00f3stica, abord\u00f3 la introducci\u00f3n a la Secuenciaci\u00f3n de Nueva Generaci\u00f3n (NGS); las tecnolog\u00edas y plataformas de NGS disponibles en el mercado; las aplicaciones cl\u00ednicas del NGS en el diagn\u00f3stico molecular y otros aspectos relevantes sobre el tema.<\/p>\t\t\t\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t<\/div>\n\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t<\/section>\n\t\t\t\t

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Preguntas y Respuestas<\/h4>\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t
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A continuaci\u00f3n, se presenta la duda que no fue respondida durante el Reuni\u00f3n Online.<\/p>\t\t\t\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t

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\n\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t1. \u00bfQu\u00e9 es exactamente el enriquecimiento de muestras?<\/a>\n\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t\t

Enriquecimiento, en el contexto de la secuenciaci\u00f3n de nueva generaci\u00f3n (NGS), se refiere a t\u00e9cnicas utilizadas para seleccionar regiones espec\u00edficas del genoma antes de la secuenciaci\u00f3n. Esto se realiza para aumentar la cobertura y la profundidad de lectura de estas regiones de inter\u00e9s, reduciendo los costos y la complejidad computacional asociados a la secuenciaci\u00f3n de genomas completos.<\/p>

Normalmente, el t\u00e9rmino enriquecimiento se utiliza para la estrategia de Captura por Hibridaci\u00f3n, que emplea sondas oligonucleot\u00eddicas biotiniladas complementarias a las regiones objetivo de inter\u00e9s en el genoma. Estas sondas hibridan con las secuencias de inter\u00e9s, que luego son aisladas usando esferas recubiertas con estreptavidina. Esta t\u00e9cnica permite la captura de regiones flanqueantes, pero tambi\u00e9n puede aislar regiones no deseadas, reduciendo la cobertura en las regiones de inter\u00e9s.<\/p>

El proceso de enriquecimiento genera una m\u00e9trica que puede evaluarse durante la secuenciaci\u00f3n: la proporci\u00f3n de secuencias que corresponden a las regiones objetivo en relaci\u00f3n con el total de secuencias generadas. Normalmente, este valor se sit\u00faa entre el 70 % y el 85 %. Por ejemplo, un enriquecimiento del 80 % indica que el 80 % de las secuencias generadas corresponden a las regiones que se pretend\u00eda capturar, mientras que el otro 20 % son de regiones no objetivo.<\/p>

Como el proceso no es perfecto, siempre habr\u00e1 un porcentaje de secuencias fuera del inter\u00e9s (off-target). Cuanto mayor sea el enriquecimiento, m\u00e1s optimizada ser\u00e1 la secuenciaci\u00f3n, ya que maximiza la cobertura de las regiones de inter\u00e9s y minimiza la generaci\u00f3n de datos irrelevantes. Esto da lugar a un an\u00e1lisis m\u00e1s eficiente y econ\u00f3mico, permitiendo una detecci\u00f3n m\u00e1s precisa de variantes gen\u00e9ticas en las regiones estudiadas.<\/p>

Referencias (pregunta 1):<\/p>

Guidelines for Validation of Next-Generation Sequencing-Based Oncology Panels: A Joint Consensus Recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. Jennings LJ, Arcila ME, Corless C, et al. The Journal of Molecular Diagnostics. 2017;19(3):341-365. doi:10.1016\/j.jmoldx.2017.01.011.<\/p>

Comparison of Three Targeted Enrichment Strategies on the SOLiD Sequencing Platform. Hedges DJ, Guettouche T, Yang S, et al. PLoS One. 2011;6(4). doi:10.1371\/journal.pone.0018595.<\/p><\/div>\n\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t\t\t\t

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\n\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t2. Cuando se utiliza un gen para secuenciar en NGS, \u00bfse puede decir que se est\u00e1 haciendo un an\u00e1lisis de metagen\u00f3mica?<\/a>\n\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t\t

No necesariamente. La metagen\u00f3mica implica la secuenciaci\u00f3n masiva y no dirigida del material gen\u00e9tico presente en una muestra, lo que permite la identificaci\u00f3n y an\u00e1lisis de todos los microorganismos o componentes gen\u00e9ticos presentes, sin necesidad de cultivo o conocimiento previo. Aunque a menudo se asocia con muestras ambientales, la metagen\u00f3mica tambi\u00e9n se aplica ampliamente en muestras cl\u00ednicas, como plasma y l\u00edquido cefalorraqu\u00eddeo (l\u00edquido), para la detecci\u00f3n de virus desconocidos u otros pat\u00f3genos.<\/p>

Ejemplos de metagen\u00f3mica en muestras cl\u00ednicas:<\/p>

– Metagen\u00f3mica del plasma o l\u00edquido cefalorraqu\u00eddeo: Utilizada para identificar virus, bacterias u otros pat\u00f3genos desconocidos en pacientes con infecciones de origen indeterminado.
– An\u00e1lisis de microbiomas humanos: Estudios que investigan la composici\u00f3n de las comunidades microbianas en el intestino, piel, boca y otras partes del cuerpo, relacion\u00e1ndolas con enfermedades o estados de salud.<\/p>

La metagen\u00f3mica puede considerarse un secuenciamiento sin premisas, donde no se dirige el an\u00e1lisis a un organismo o gen espec\u00edfico. En su lugar, el objetivo es obtener una visi\u00f3n amplia del material gen\u00e9tico presente en la muestra, permitiendo que los datos revelen qu\u00e9 organismos o secuencias est\u00e1n presentes.<\/p>

Por otro lado, cuando se secuencia un gen espec\u00edfico usando NGS, generalmente se est\u00e1 realizando un secuenciamiento dirigido o de amplic\u00f3n, enfocado en una regi\u00f3n particular del genoma. Este m\u00e9todo requiere conocimiento previo sobre el gen o organismo de inter\u00e9s y no se considera metagen\u00f3mico, ya que no proporciona informaci\u00f3n sobre otros organismos o secuencias presentes en la muestra.<\/p>

Por lo tanto, para ser considerada un an\u00e1lisis metagen\u00f3mico, la secuenciaci\u00f3n debe ser amplia y no dirigida, permitiendo la identificaci\u00f3n de m\u00faltiples organismos o componentes gen\u00e9ticos sin premisas previas. Secuenciar solo un gen espec\u00edfico no caracteriza un enfoque metagen\u00f3mico.<\/p>

Referencias (pregunta 2):<\/p>

Advances in Metagenomics and Its Application in Environmental Microorganisms.
Zhang L, Chen F, Zeng Z, et al. Frontiers in Microbiology. 2021;12:766364. doi:10.3389\/fmicb.2021.766364.<\/p>

From Genomics to Metagenomics in the Era of Recent Sequencing Technologies.
Benz S, Mitra S. Methods in Molecular Biology. 2023;2649:1-20. doi:10.1007\/978-1-0716-3072-3_1.<\/p>

STROBE-metagenomics: A STROBE Extension Statement to Guide the Reporting of Metagenomics Studies.
Bharucha T, Oeser C, Balloux F, et al. The Lancet Infectious Diseases. 2020;20(10). doi:10.1016\/S1473-3099(20)30199-7.<\/p>

Recent Advances in Metagenomic Approaches, Applications, and Challenges.
Lema NK, Gemeda MT, Woldesemayat AA. Current Microbiology. 2023;80(11):347. doi:10.1007\/s00284-023-03451-5.<\/p>

Metagenomic Data Assembly – The Way of Decoding Unknown Microorganisms.
Lapidus AL, Korobeynikov AI. Frontiers in Microbiology. 2021;12:613791. doi:10.3389\/fmicb.2021.613791.<\/p>

What Is Metagenomics Teaching Us, and What Is Missed?
New FN, Brito IL. Annual Review of Microbiology. 2020;74:117-135. doi:10.1146\/annurev-micro-012520-072314.<\/p><\/div>\n\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t\t\t\t

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\n\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t3. \u00bfQu\u00e9 puede generar resultados con cobertura por debajo de lo deseado?<\/a>\n\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t\t

Las regiones de baja cobertura en los resultados de secuenciaci\u00f3n de nueva generaci\u00f3n (NGS) pueden ser causadas por diversos factores, como se evidencia en la literatura m\u00e9dica:<\/p>

Composici\u00f3n de la secuencia, especialmente el contenido de GC (Guanina\/Citosina):<\/p>

Las regiones ricas en GC son notoriamente dif\u00edciles de secuenciar y frecuentemente resultan en baja cobertura, menor calidad de base y dificultades en el mapeo, adem\u00e1s de un alto sesgo de cadena, comprometiendo la sensibilidad en la detecci\u00f3n de variantes.<\/p>

Elementos repetitivos y duplicaciones segmentarias tambi\u00e9n est\u00e1n asociados a regiones de baja cobertura.<\/p>

Metodolog\u00eda de preparaci\u00f3n de la biblioteca:<\/p>

La forma en que se prepara la biblioteca de secuenciaci\u00f3n puede influir significativamente en la cobertura.<\/p>

Ciertos kits de preparaci\u00f3n de biblioteca est\u00e1n asociados a un sesgo de cobertura dependiente del contenido de GC, especialmente en especies bacterianas con bajo contenido de GC.<\/p>

Los m\u00e9todos de fragmentaci\u00f3n de ADN, como la sonicaci\u00f3n, pueden introducir sesgos no aleatorios que afectan la uniformidad de la cobertura.<\/p>

Limitaci\u00f3n de mapeabilidad de lecturas cortas:<\/p>

La dificultad para mapear lecturas cortas en regiones espec\u00edficas del genoma puede resultar en una cobertura no uniforme.<\/p>

Esto puede ser un problema significativo en plataformas de secuenciaci\u00f3n de exoma (WES) y genoma completo (WGS), donde la complejidad del genoma puede dificultar la alineaci\u00f3n precisa de las lecturas.<\/p>

Calidad y cantidad del \u00e1cido nucleico inicial:<\/p>

\u00c1cidos nucleicos de baja calidad o cantidad insuficiente pueden llevar a una cobertura inadecuada.<\/p>

Eficiencia de los m\u00e9todos de captura y amplificaci\u00f3n:<\/p>

El sesgo de amplificaci\u00f3n es una limitaci\u00f3n conocida en enfoques basados en amplicones de PCR, lo que puede resultar en un rendimiento inferior de ciertos amplicones.<\/p>

Por lo tanto, la baja cobertura en NGS puede atribuirse a una combinaci\u00f3n de factores relacionados con la composici\u00f3n de la secuencia, m\u00e9todos de preparaci\u00f3n de la biblioteca, mapeabilidad de las lecturas, calidad del \u00e1cido nucleico y eficiencia de los m\u00e9todos de captura y amplificaci\u00f3n.<\/p>

Referencias (pregunta 3):<\/p>

Standards and Guidelines for Validating Next-Generation Sequencing Bioinformatics Pipelines: A Joint Recommendation of the Association for Molecular Pathology and the College of American Pathologists.
Roy S, Coldren C, Karunamurthy A, et al. The Journal of Molecular Diagnostics. 2018;20(1):4-27. doi:10.1016\/j.jmoldx.2017.11.003.<\/p>

Coverage Analysis in a Targeted Amplicon-Based Next-Generation Sequencing Panel for Myeloid Neoplasms.
Yan B, Hu Y, Ng C, et al. Journal of Clinical Pathology. 2016;69(9):801-804. doi:10.1136\/jclinpath-2015-203580.<\/p>

The Efficiency of Tagmentation Depends on G and C Bases in the Binding Motif Leading to Uneven Coverage in Bacterial Species With Low and Neutral GC-content.
Segerman B, \u00c1stvaldsson \u00c1, Mustafa L, Skarin J, Skarin H. Frontiers in Microbiology. 2022;13:944770. doi:10.3389\/fmicb.2022.944770.<\/p>

Novel Metrics to Measure Coverage in Whole Exome Sequencing Datasets Reveal Local and Global Non-Uniformity.
Wang Q, Shashikant CS, Jensen M, Altman NS, Girirajan S. Scientific Reports. 2017;7(1):885. doi:10.1038\/s41598-017-01005-x.<\/p>

Non-Random DNA Fragmentation in Next-Generation Sequencing.
Poptsova MS, Il’icheva IA, Nechipurenko DY, et al. Scientific Reports. 2014;4:4532. doi:10.1038\/srep04532.<\/p>

Systematic Dissection of Biases in Whole-Exome and Whole-Genome Sequencing Reveals Major Determinants of Coding Sequence Coverage.
Barbitoff YA, Polev DE, Glotov AS, et al. Scientific Reports. 2020;10(1):2057. doi:10.1038\/s41598-020-59026-y.<\/p><\/div>\n\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t\t\t\t

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\n\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t4. \u00bfCu\u00e1les son las principales referencias bibliogr\u00e1ficas para protocolos de validaci\u00f3n y verificaci\u00f3n de NGS?<\/a>\n\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t\t

Como prometido, aqu\u00ed est\u00e1n las principales referencias que abordan protocolos de validaci\u00f3n y verificaci\u00f3n en NGS:<\/p>

Validation and Benchmarking of Targeted Panel Sequencing for Cancer Genomic Profiling.
Wang D, Wang S, Zhang Y, et al. American Journal of Clinical Pathology. 2023;160(5):507-523. doi:10.1093\/ajcp\/aqad078.<\/p>

Standards and Guidelines for Validating Next-Generation Sequencing Bioinformatics Pipelines: A Joint Recommendation of the Association for Molecular Pathology and the College of American Pathologists.
Roy S, Coldren C, Karunamurthy A, et al. The Journal of Molecular Diagnostics. 2018;20(1):4-27. doi:10.1016\/j.jmoldx.2017.11.003.<\/p>

Assembling and Validating Bioinformatic Pipelines for Next-Generation Sequencing Clinical Assays.
SoRelle JA, Wachsmann M, Cantarel BL. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 2020;144(9):1118-1130. doi:10.5858\/arpa.2019-0476-RA.<\/p>

Comprehensive Analysis to Improve the Validation Rate for Single Nucleotide Variants Detected by Next-Generation Sequencing.
Park MH, Rhee H, Park JH, et al. PLoS One. 2014;9(1). doi:10.1371\/journal.pone.0086664.<\/p>

Human Papillomavirus Detection by Whole-Genome Next-Generation Sequencing: Importance of Validation and Quality Assurance Procedures.
M\u00fchr LSA, Guerendiain D, Cuschieri K, Sundstr\u00f6m K. Viruses. 2021;13(7):1323. doi:10.3390\/v13071323.<\/p>

Minimal Requirements for ISO15189 Validation and Accreditation of Three Next Generation Sequencing Procedures for SARS-CoV-2 Surveillance in Clinical Setting.
Maschietto C, Otto G, Rouz\u00e9 P, et al. Scientific Reports. 2023;13(1):6934. doi:10.1038\/s41598-023-3408.<\/p><\/div>\n\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t<\/div>\n\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t<\/section>\n\t\t\t\t<\/div>\n\t\t","protected":false},"featured_media":170920,"menu_order":0,"template":"","meta":{"_acf_changed":false},"encontro_online_cat":[2839],"idioma-do-video":[2876],"segmento":[2831],"class_list":["post-170925","encontros_online","type-encontros_online","status-publish","has-post-thumbnail","hentry","encontro_online_cat-biologia-molecular","idioma-do-video-portugues","segmento-clinico"],"acf":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/controllab.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/encontros_online\/170925","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/controllab.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/encontros_online"}],"about":[{"href":"https:\/\/controllab.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/types\/encontros_online"}],"version-history":[{"count":2,"href":"https:\/\/controllab.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/encontros_online\/170925\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":170964,"href":"https:\/\/controllab.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/encontros_online\/170925\/revisions\/170964"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/controllab.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/media\/170920"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/controllab.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=170925"}],"wp:term":[{"taxonomy":"encontro_online_cat","embeddable":true,"href":"https:\/\/controllab.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/encontro_online_cat?post=170925"},{"taxonomy":"idioma-do-video","embeddable":true,"href":"https:\/\/controllab.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/idioma-do-video?post=170925"},{"taxonomy":"segmento","embeddable":true,"href":"https:\/\/controllab.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/segmento?post=170925"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}