O ensaio de proficiência (EP) ideal avalia todas as etapas do processo (global) e é
composto pelo mesmo tipo de material biológico testado no dia a dia. No entanto,
isso nem sempre é possível. Algumas amostras são raras, outras instáveis ou
escassas. Diante disso, alternativas são aceitáveis, bastas justificá-las e a justificativa
ser coerente. É melhor ter um EP baseado em DNA extraído que contemple um grupo
de laboratórios do que um controle externo alternativo entre dois laboratórios.

Análise quantitativa absoluta é considerada o ápice dos ensaios moleculares, pois
fornece informações cruciais sobre a concentração e a quantidade das moléculas de
interesse, desempenhando um papel fundamental em várias aplicações clínicas. Seu
controle interno da qualidade deve contemplar 3 concentrações (alta, média e baixa)
representando toda faixa linear do ensaio. Normalmente, a unidade destes resultados
é: cópias/mL, UI/mL, ng/mL, equivalentes genômicos/mL, e outras. Análise do ciclo
quantitativo (Cq) bruto não é aplicável para quantificação absoluta, mas sim, sua
interpolação contra uma curva padrão. Para cada concentração testada avalia-se se o
valor observado na corrida analítica esta dentro do valor esperado definido durante a
validação, no início do novo lote de controle, ou com resultado esperado. Pode-se
usar o gráfico de levey-jennigs para se avaliar visualmente os diferentes níveis de
controle ao longo do tempo.

Existem diferentes estratégias de validação de métodos: a) aplicar método teste em
amostras com resultado conhecido, b) comparar métodos teste com um método já
validado, c) comparar dois métodos testes independentes, d) comparar método teste
com diagnóstico clínico do paciente, e outras. Na estratégia “c” compara-se o método
teste com um outro método teste independente. Esta situação é mais aplicável para
testes inexistentes ou novas tecnologias, como o NGS, por exemplo. Enviar amostras
para outro laboratório é uma opção, seria a situação “b”, método teste contra método
já validado. Em relação ao envio de amostras de pacientes para outro laboratório, sim,
é necessário obedecer a LGPD. Neste sentido, é importante obter a autorização do
paciente para uso do remanescente da sua amostra anonimizada em validação no
momento do cadastro do exame, antes de se conhecer o resultado da sua amostra.

Uma referência recente sobre validação e controle de qualidade em NGS é o CLSI
MM09 “Human Genetic and Genomic Testing Using Traditional and High-Throughput
Nucleic Acid Sequencing Methods, 3rd Edition” (https://clsi.org/mm09).

São apenas termos diferentes e equivalem a sensibilidade e especificidade em uma
tabela 2×2. Realmente, sensibilidade/especificidade são amplamente conhecidos e
usados, os termos concordância positiva/negativa não são. Tradicionalmente, em uma
tabela 2×2, onde se compara um método teste com a presença ou ausência de doença
ou com método padrão ouro obtém-se sensibilidade (a/a+c), especificidade (d/b+d),
valor preditivo positivo (a/a+b) e valor preditivo negativo (d/c+d). No entanto, quanto
são comparados dois “métodos testes”, em que se desconhece a presença ou ausência
da doença ou não exista um teste padrão ouro para o analito em questão, a
denominação correta para (a/a+c) é concordância positiva e (d/b+d) é concordância
negativa. Neste caso, se tem também a concordância total entre os métodos
(a+d/a+b+c+d). O CLSI EP12 “Evaluation of Qualitative, Binary Output Examination
Performance, 3rd Edition” descreve a avaliação de desempenho de métodos
qualitativos e estes termos
(https://clsi.org/standards/products/method-evaluation/documents/ep12/).

Isso mesmo. Para um ensaio qualitativo de qPCR a análise da precisão somente é
aplicável próxima ao LOD, pois trata-se do ponto de decisão clínica. Ou seja,
detectado ou não detectado para o analito. Toda a faixa em que o ensaio retorna
resultado positivo acima disso passa a ser irrelevante, pois sempre se tem resultados
“detectado”. Então, na validação, é necessário conhecer a precisão do ensaio próximo
ao LOD 95% por dois motivos: 1) evitar uso de ensaio pouco precisos em que o LOD
varia muito entre corridas analíticas e; 2) fundamentar a decisão se uma amostra é
detectada, indeterminada ou não detectada no dia-a-dia.

A diluição 1:10 (com 5-6 pontos) define o intervalo analítico do ensaio e ajuda a
escolher o ponto inicial da diluição 1:2 para definição do LOD. Deve-se escolher um
ponto reprodutível qualitativamente da diluição 1:10 (ex. detectado em triplicata,
mesmo que o Cq varie um pouco) e usá-lo como ponto de partida para diluição 1:2
para definição do LOD (normalmente 5-6 pontos também). Para definir o LOD, basta
executar a diluição 1:2 uma vez e aplicar a regressão probit. Para definir a precisão no
LOD (na zona cinza), basta repetir a curva 1:2 do LOD de 3 a 5 vezes ou testar uma
segunda diluição 1:10 com apenas 3 pontos a partir do mesmo ponto escolhido para
se iniciar a diluição 1:2 (essa regra não é fixa, pode variar de acordo com os resultados
obtidos). Particularmente, prefiro repetir a curva de LOD 3-5 vezes.

Existem algumas estratégias de normalização do resultado da qPCR para facilitar
comparações entre amostras: tamanho/volume da amostra, quantidade de DNA
genômico, Cq de um gene de referência, e cq de um DNA exógeno (Leitura
recomendada PMID: 15815687). O DNA genômico da amostra pode sim ser usado
como normalizador. No entanto, como existe variação biológica na quantidade de
leucócitos, assumir que todo 200 ul de sangue tem 3000 células pode gerar
comparações errôneas. Uma estimativa da quantidade de DNA na amostra pode ser
obtida da análise do controle de reação/endógeno/interno da qPCR. O uso de
equivalente genômicos também pode ser aplicável para esta situação – cada célula
tem 6,6 pg de DNA (PMID: 17163815).

Eu precisaria de mais informações para responder com mais propriedade essa
pergunta: tipo de amostra, tipo quantificação (relativa x absoluta), patógeno
pesquisado, uso de controle de reação endógeno/exógeno. Assim, poderia
compreender melhor a questão biológica relativa à pergunta. A busca de publicações
específicas a respeito da qPCR em questão podem ajudar a encontrar os cálculos. No
entanto, na maioria dos casos, os tipos cálculos são os mesmos independente da
relação entre quantidade de DNA humano e do patógeno, pois a qPCR tende a
amplificar pequenas quantidade do DNA do patógeno misturados em uma grande
quantidade de DNA humano. Essa relação DNA patógeno/humano com prevalência
do DNA humano tende a aumentar o limite de detecção do ensaio, deixando a PCR
menos sensível, mas uso de estratégias especificas pode resolver a questão. Fique à
vontade para me passar mais detalhes.