O Encontro Online foi ministrado pela Julia Baruque, Bacharel em Microbiologia e Imunologia (UFRJ), Mestre em Engenharia de Processos Bioquímicos (UFRJ) e Analista Técnica na Controllab.
A aula apresentou a importância das cepas de referência, as exigências normativas para seu uso, critérios de seleção e conservação, além dos principais erros na rotina laboratorial e boas práticas de biossegurança.
Com conteúdo atualizado, a capacitação ajudou os participantes a aprimorar seus processos internos, promovendo resultados mais confiáveis e maior segurança na condução dos procedimentos microbiológicos.
Perguntas & Respostas
A seguir, encontram-se as dúvidas que não foram respondidas durante o Encontro Online.
Microrganismos anaeróbios, como C. perfringens, além da incubação em jarra de anaerobiose, quais cuidados adicionais devem ser adotados para garantir a preservação adequada da cultura? As placas de cultivo e os tubos contendo meio crioprotetor necessitam de condições de armazenamento diferentes?
Para microrganismos anaeróbios como C. perfringens, além da jarra de anaerobiose, é essencial manipular rapidamente para evitar exposição ao oxigênio, incubar imediatamente após o plaqueamento e garantir que todo o processo ocorra em ambiente minimamente oxidante. As placas devem ser armazenadas apenas por curtos períodos em geladeira, sempre seladas, enquanto os criotubos com meio crioprotetor devem ser mantidos exclusivamente a -80°C, pois são destinados ao armazenamento de longo prazo e não devem ser submetidos às mesmas condições de placas.
Gostaria de confirmar caso encontre uma diferença no resultado, quando utilizo NCTC e ATCC, o que explicaria essa discrepância?
Não é esperado observar variações significativas entre resultados obtidos com cepas NCTC e ATCC, já que ambas são coleções de referência altamente padronizadas e reconhecidas internacionalmente. Quando uma discrepância ocorre, o mais provável é que esteja relacionada a fatores internos da própria unidade, como condições de cultivo, preparo do inóculo, integridade do meio, parâmetros de incubação, equipamentos ou até falhas no manuseio da cepa. Assim, diante de qualquer diferença, a unidade deve imediatamente acionar seus processos internos de verificação, revisando procedimentos, conferindo registros e realizando controles adicionais para garantir que tudo esteja conforme o esperado.
A validade da cepa congelada não seria de acordo com a planilha do livro da Opustil e a validade do certificado não seria apenas para o prazo para ressuspender esta cepa liofilizada?
A planilha apresentada no descreve, de forma geral, as melhores condições e possibilidades de armazenamento para cada tipo de microrganismo, incluindo períodos estimados de estabilidade. No entanto, esses prazos são orientações técnicas amplas. A validade que deve ser rigorosamente seguida é sempre a fornecida pelo produtor da cepa, registrada no certificado ou na documentação oficial. Essa validade informada pelo fornecedor considera testes específicos de estabilidade, logística, lote e condições reais de produção. Portanto, mesmo que o livro ofereça referências gerais, é a validade oficial do fornecedor que deve ser respeitada para garantir conformidade e rastreabilidade.
Como podemos ter acesso às informações sobre alterações de validade das cepas de referência? Observamos que, em alguns casos, há retestes e novas validades nos lotes, mas essas atualizações nem sempre chegam aos usuários. Existe algum canal específico para acompanhamento dessas atualizações?
As alterações de validade de cepas de referência e os resultados de retestes são publicados diretamente pelos fornecedores em seus sites oficiais, normalmente na página individual de cada cepa. Alguns produtores disponibilizam newsletters, mas não existe um canal padrão que envie automaticamente essas atualizações ao usuário, então é responsabilidade do laboratório consultar periodicamente o site da coleção para verificar se houve alteração ou fazer outro tipo de contato com o fornecedor.
Alguma orientação para manutenção de cepa de S. pneumoniae e H. influenza ? Trabalhamos com armazenagem em -80 e descongelamento mensal e repique semanal, mas muitas vezes eles não permanecem viáveis em geladeiras ou contaminam em temperatura ambiente.
S. pneumoniae e H. influenzae são organismos muito sensíveis e exigem estoques em -80°C com crioprotetor, repiques extremamente frescos, incubação em atmosferas enriquecidas (como CO₂ para S. pneumoniae) e mínimo tempo possível em geladeira ou temperatura ambiente. Essas cepas perdem viabilidade rapidamente fora das condições ideais, o que explica a dificuldade em mantê-las em condições mais brandas.
O exemplo que foi dado para culturas de trabalho foi referente a cepas liofilizadas da Controllab. Mas este processo funcionaria com alguma outra apresentação de alguma outra empresa?
Sim, este plano de trabalho funciona bem independentemente do fornecedor. O único ponto de atenção é que o laboratório precisa seguir exatamente as instruções de uso do fornecedor no momento de reconstituir a cepa. Mas depois do microrganismo reconstituído em placa, o laboratório pode sim seguir com o plano de trabalho que foi apresentado.
Qual seria a contingência para descarte de microorganismos caso a autoclave venha a parar? O município tem serviço de tratamento de resíduos. Pode ser saco vermelho?
Se a autoclave parar, o descarte de microrganismos deve seguir um plano de contingência que inclua acondicionamento dos resíduos em saco vermelho, armazenamento temporário seguro e encaminhamento ao serviço licenciado de tratamento de resíduos do município. Todo o procedimento deve ser registrado até o restabelecimento da rotina normal.
Sabe se existe algum estudo sobre a perda do gene MecA da cepa S.aureus NCTC 12493, ou algum outro mecanismo que a cepa perde para começar a dar resultados do halo do ATB mais alto do que o esperado?
Há relatos de perda parcial ou total do elemento SCCmec ou diminuição da expressão do gene mecA em S. aureus NCTC 12493, especialmente após repiques sucessivos ou condições de estresse. Essa perda ou silenciamento fenotípico pode levar a halos maiores do que o esperado, caracterizando uma “perda funcional” da resistência.
Qual seria o motivo das placas estarem com excesso de umidade na geladeira?
O excesso de umidade nas placas geralmente ocorre porque elas foram colocadas na geladeira ainda quentes, o que causa condensação, ou devido a flutuações de temperatura na geladeira, falta de selagem ou composição do meio com excesso de água. Geladeiras comuns com umidade elevada também favorecem esse problema.
No meu processo, eu posso utilizar uma cepa oriunda de uma coleção de culturas, mas que não é acreditada pela ISO 17034?
É possível utilizar uma cepa proveniente de uma coleção não acreditada pela ISO 17034, desde que o ensaio não exija formalmente um Material de Referência Certificado. Para ensaios acreditados, entretanto, a ISO 17025 exige o uso de MRC proveniente de um produtor acreditado.
Existe alguma recomendação específica para manipulação de MRCs nos testes de promoção de crescimento e padronização de inóculo para verificação de métodos?
A manipulação de MRCs em testes de promoção de crescimento e padronização de inóculo deve ser feita sempre a partir de culturas recém-hidratadas ou recém-descongeladas, evitando culturas antigas e repiques repetidos. É fundamental manter rastreabilidade, registrar lote, caracterizações e garantir que o inóculo esteja dentro do padrão estabelecido pelo método.
Posso adquirir cepas qualitativas para realizar testes quantitativos?
Sim. No caso de aplicações quantitativas, o laboratório pode realizar esta contagem do microrganismo (como contagem em placa, por exemplo), ajustar a concentração para a faixa desejada e, então, utilizá-la em seu processo quantitativo.
Quais as possíveis ações caso a rodada extra não atinja os resultados esperados?
Caso a rodada extra não atinja os resultados esperados, o laboratório deve revisar as condições de inoculação, qualidade dos meios, equipamentos e procedimentos, além de abrir uma investigação interna para tratar a inconsistência nos resultados.
Após o congelamento das pérolas em criotubo, cada pérola deve ser retirada individualmente com ferramenta estéril, sem permitir o descongelamento do tubo. Apenas uma pérola deve ser usada por vez e o criotubo deve retornar imediatamente ao -80°C.
Após o congelamento das pérolas em criotubo, cada pérola deve ser retirada individualmente com ferramenta estéril, sem permitir o descongelamento do tubo. Apenas uma pérola deve ser usada por vez e o criotubo deve retornar imediatamente ao -80°C.
O tsb/glicerol já é estéril, segundo a bula, por que a orientação de autoclavar?
Embora o TSB/glicerol fornecido comercialmente seja estéril de fábrica, a orientação de autoclavar após o fracionamento não está relacionada à qualidade do produto original, mas sim às exigências de controle interno do processo. A autoclavação garante a esterilidade do meio no ambiente específico do laboratório, após a abertura do frasco, manipulação e distribuição em criotubos. Esse procedimento elimina qualquer risco de contaminação introduzido durante o manuseio e mantém a padronização exigida por normas de qualidade e biossegurança, como BPF, ISO 17025 e BPL.
O meio PCA Plate Count Agar é ideal para o cultivo das cepas? Ou temos outro meio mais adequado no mercado?
O meio PCA é útil para contagem total de bactérias aeróbias, mas não é o mais adequado para todas as cepas de referência, especialmente para organismos fastidiosos ou para testes de sensibilidade. De forma geral, meios como TSA, BHI, chocolate ou Mueller-Hinton fornecem melhores condições para a maioria das cepas, no entanto deve-se utilizar os meios de cultura recomendado nos certificados emitidos pelos fornecedores de cepas.
Se o laboratório tem condições de armazenar as cepas liofilizadas (período longo), por que devemos seguir a validade do certificado destas cepas?
Mesmo que o laboratório tenha condições de armazenar a cepa liofilizada por longos períodos, é obrigatório seguir a validade do certificado, pois o produtor só garante a estabilidade e os atributos analíticos da cepa até aquele prazo. Após o vencimento, não há garantia de que o perfil genotípico e fenotípico está preservado e apenas o fabricante pode revalidar o produto.
Eu posso fazer um trabalho demonstrando a manutenção da estabilidade das amostras após o que determina o fabricante?
É permitido realizar um estudo interno demonstrando que a cepa permanece estável além do prazo indicado pelo fabricante, mas esses resultados não substituem a validade do certificado e não podem ser usados para justificar o uso da cepa em ensaios acreditados. Servem apenas como avaliação técnica interna. O uso de produtos vencidos é proibido no Brasil e considerados infrações graves ao Código de Defesa do Consumidor (CDC), além de poderem configurar crime contra a saúde pública.
Temos problema em manter a cepa de Campy. Alguma dica para armazenamento e repique para uso diário?
Campylobacter é extremamente sensível e para mantê-lo viável é necessário realizar repiques diários em microaerofilia, utilizar meios específicos e sempre frescos, manter estoques congelados em -80°C com crioprotetor e nunca deixar culturas em temperatura ambiente ou geladeira. Mesmo pequenas variações ambientais podem comprometer sua viabilidade.
