La Reunión Online fue impartida por Julia Baruque, Licenciada en Microbiología e Inmunología (UFRJ), Magíster en Ingeniería de Procesos Bioquímicos (UFRJ) y Analista Técnica en Controllab.
La clase presentó la importancia de las cepas de referencia, los requisitos normativos para su uso, criterios de selección y conservación, además de los principales errores en la rutina de laboratorio y las buenas prácticas de bioseguridad.
Con contenido actualizado, la capacitación ayudó a los participantes a mejorar sus procesos internos, promoviendo resultados más confiables y mayor seguridad en la conducción de los procedimientos microbiológicos.
Preguntas y Respuestas
A continuación, se encuentran las dudas que no fueron respondidas durante la Reunión Online.
Microorganismos anaerobios, como C. perfringens: además de la incubación en jarra de anaerobiosis, ¿qué cuidados adicionales deben adoptarse para garantizar una adecuada preservación del cultivo? ¿Las placas de cultivo y los tubos con medio crioprotector requieren condiciones de almacenamiento diferentes?
Para microorganismos anaerobios como C. perfringens, además de la jarra de anaerobiosis, es esencial manipular rápidamente para evitar la exposición al oxígeno, incubar inmediatamente después del sembrado y asegurar que todo el proceso ocurra en un ambiente mínimamente oxidante. Las placas deben almacenarse solo por periodos cortos en refrigeración, siempre selladas, mientras que los criotubos con medio crioprotector deben mantenerse exclusivamente a -80 °C, ya que están destinados al almacenamiento a largo plazo y no deben someterse a las mismas condiciones que las placas.
Si encuentro una diferencia en los resultados utilizando NCTC y ATCC, ¿qué podría explicar esta discrepancia?
No se esperan variaciones significativas entre resultados obtenidos con cepas NCTC y ATCC, ya que ambas son colecciones de referencia altamente estandarizadas y reconocidas internacionalmente. Cuando ocurre una discrepancia, lo más probable es que esté relacionada con factores internos de la propia unidad, como condiciones de cultivo, preparación del inóculo, integridad del medio, parámetros de incubación, equipos o incluso fallas en la manipulación de la cepa. Ante cualquier diferencia, la unidad debe activar inmediatamente sus procesos internos de verificación, revisando procedimientos, comprobando registros y realizando controles adicionales para garantizar que todo esté conforme.
¿La validez de la cepa congelada no debería seguir la planilla del libro de Opustil, y la del certificado no sería únicamente el plazo para rehidratar la cepa liofilizada?
La planilla presentada describe, de forma general, las mejores condiciones y posibilidades de almacenamiento para cada tipo de microorganismo, incluyendo periodos estimados de estabilidad. Sin embargo, estos plazos son orientaciones técnicas generales. La validez que debe seguirse rigurosamente es siempre la proporcionada por el productor de la cepa, registrada en el certificado o en la documentación oficial. Esa validez considera pruebas específicas de estabilidad, logística, lote y condiciones reales de producción. Por lo tanto, aunque el libro ofrezca referencias generales, es la validez oficial del proveedor la que debe respetarse para asegurar conformidad y trazabilidad.
¿Cómo podemos acceder a información sobre cambios en la validez de las cepas de referencia? Observamos que, en algunos casos, hay retests y nuevas validades en los lotes, pero estas actualizaciones no siempre llegan a los usuarios. ¿Existe algún canal específico para hacer este seguimiento?
Las actualizaciones de validez y los resultados de retests son publicadas directamente por los proveedores en sus sitios oficiales, normalmente en la página individual de cada cepa. Algunos productores ofrecen boletines informativos, pero no existe un canal estándar que envíe automáticamente estas actualizaciones a los usuarios.
Por ello, corresponde al laboratorio consultar periódicamente el sitio de la colección o establecer otro tipo de contacto con el proveedor.
¿Alguna orientación para el mantenimiento de S. pneumoniae y H. influenzae? Trabajamos con almacenamiento a -80 °C, descongelamiento mensual y repique semanal, pero muchas veces no permanecen viables en refrigeración o se contaminan a temperatura ambiente.
S. pneumoniae y H. influenzae son organismos muy sensibles y requieren stocks a -80 °C con crioprotector, repiques extremadamente frescos, incubación en atmósferas enriquecidas (como CO₂ para S. pneumoniae) y el mínimo tiempo posible en refrigeración o temperatura ambiente. Pierden viabilidad rápidamente fuera de las condiciones ideales, lo que explica la dificultad para mantenerlos en condiciones más suaves.
El ejemplo dado para culturas de trabajo se refirió a cepas liofilizadas de Controllab. ¿Este proceso funcionaría con otra presentación de otro proveedor?
Sí, este plan de trabajo funciona bien independientemente del proveedor. El único punto de atención es que el laboratorio debe seguir exactamente las instrucciones del fabricante en el momento de reconstituir la cepa. Pero después de reconstituida en placa, el laboratorio puede seguir el plan de trabajo presentado.
¿Cuál sería la contingencia para descartar microorganismos si la autoclave deja de funcionar? El municipio tiene servicio de tratamiento de residuos. ¿Puede utilizarse la bolsa roja?
Si la autoclave deja de funcionar, el descarte de microorganismos debe seguir un plan de contingencia que incluya acondicionamiento de los residuos en bolsa roja, almacenamiento temporal seguro y envío al servicio municipal licenciado para tratamiento de residuos.
Todo el procedimiento debe registrarse hasta que la rutina normal sea restablecida.
¿Existe algún estudio sobre la pérdida del gen mecA en S. aureus NCTC 12493 u otro mecanismo que haga que la cepa empiece a presentar halos de ATB mayores a los esperados?
Hay informes de pérdida parcial o total del elemento SCCmec o de disminución en la expresión del gen mecA en S. aureus NCTC 12493, especialmente después de repiques sucesivos o condiciones de estrés. Esta pérdida o silenciamiento fenotípico puede generar halos mayores de lo esperado, caracterizando una “pérdida funcional” de la resistencia.
¿Por qué las placas presentan exceso de humedad en el refrigerador?
El exceso de humedad generalmente ocurre porque las placas fueron colocadas en el refrigerador aún calientes, lo que causa condensación, o debido a fluctuaciones de temperatura, falta de sellado o composición del medio con exceso de agua. Refrigeradores comunes con alta humedad también favorecen este problema.
¿Puedo utilizar una cepa proveniente de una colección no acreditada por ISO 17034?
Es posible utilizar una cepa proveniente de una colección no acreditada por ISO 17034, siempre que el ensayo no exija formalmente un Material de Referencia Certificado. Para ensayos acreditados, sin embargo, la ISO 17025 exige el uso de MRC proveniente de un productor acreditado.
¿Alguna recomendación específica para la manipulación de MRC en pruebas de promoción de crecimiento y estandarización de inóculo?
La manipulación debe hacerse siempre a partir de cultivos recién hidratados o recién descongelados, evitando cultivos antiguos o repiques repetidos. Es fundamental garantizar trazabilidad, registrar lote y caracterizaciones, y asegurar que el inóculo esté dentro del patrón establecido por el método.
¿Puedo adquirir cepas cualitativas para realizar pruebas cuantitativas?
Sí. Para aplicaciones cuantitativas, el laboratorio puede realizar la propia cuantificación (como recuento en placa), ajustar la concentración a la franja deseada y utilizarla en su proceso cuantitativo.
¿Qué acciones tomar si la ronda extra no alcanza los resultados esperados?
El laboratorio debe revisar condiciones de inoculación, calidad de los medios, equipos y procedimientos, además de abrir una investigación interna para tratar la inconsistencia.
Después del congelamiento de las perlas en criotubo, ¿cómo deben utilizarse?
Cada perla debe retirarse individualmente con herramienta estéril, sin permitir que el tubo se descongele. Solo debe usarse una perla por vez y el criotubo debe volver inmediatamente a -80 °C.
Si el TSB/glicerol viene estéril de fábrica, ¿por qué la orientación de autoclavarlo?
Aunque el TSB/glicerol sea estéril de origen, la orientación de autoclavarlo después del fraccionamiento no se relaciona con la calidad original, sino con los requisitos de control interno. La autoclave garantiza la esterilidad del medio dentro del entorno específico del laboratorio, después de la apertura y manipulación, eliminando cualquier riesgo de contaminación introducida y asegurando la estandarización exigida por normas como BPF, ISO 17025 y BPL.
¿Es el PCA (Plate Count Agar) el medio ideal para el cultivo de las cepas? ¿O existe algún medio más adecuado?
El PCA es útil para el recuento total de bacterias aerobias, pero no es el más adecuado para todas las cepas de referencia, especialmente para organismos exigentes o pruebas de sensibilidad. En general, medios como TSA, BHI, chocolate o Mueller-Hinton ofrecen mejores condiciones; no obstante, deben utilizarse los medios recomendados en los certificados del proveedor.
Si el laboratorio tiene condiciones de almacenar cepas liofilizadas por largo tiempo, ¿por qué debe seguirse la validez del certificado?
Aunque el laboratorio tenga capacidad de almacenar la cepa por periodos prolongados, es obligatorio seguir la validez del certificado, ya que el productor solo garantiza estabilidad y atributos analíticos hasta esa fecha. Después del vencimiento, no hay garantía del perfil genotípico ni fenotípico, y solo el fabricante puede revalidar el producto.
¿Puedo realizar un estudio demostrando la estabilidad de la cepa más allá del plazo indicado por el fabricante?
Es posible realizar un estudio interno que demuestre estabilidad, pero estos resultados no sustituyen la validez del certificado y no pueden usarse para justificar el uso de la cepa en ensayos acreditados. El uso de productos vencidos es prohibido en Brasil y constituye infracción al Código de Defensa del Consumidor, además de poder caracterizar delito contra la salud pública.
Tenemos dificultad para mantener Campylobacter. ¿Alguna recomendación para almacenamiento y repique para uso diario?
Campylobacter es extremadamente sensible. Para mantener su viabilidad es necesario realizar repiques diarios en microaerofilia, usar medios específicos y siempre frescos, mantener stocks congelados a -80 °C con crioprotector y nunca dejar cultivos a temperatura ambiente o en refrigeración. Incluso pequeñas variaciones ambientales pueden comprometer su viabilidad.
